ENGENHARIA GENÉTICA

O QUE É?

A Engenharia Genética consiste num conjunto de técnicas que possibilitam, relativamente aos genes, a sua identificação, manipulação, propagação e transporte entre diferentes seres vivos.

É uma ciência recente, que emergiu da simultaneidade entre o avanço da tecnologia e o avanço do conhecimento científico na área do DNA. Devido às suas enormes potencialidades de obtenção de informação e de manipulação dos seres vivos, é uma área da Ciência envolta em polémica e que deve ser acompanhada pela sociedade em geral.

FERRAMENTAS

As técnicas desenvolvidas em Engenharia Genética utilizam «ferramentas» próprias, em larga medida desenvolvidas pelas células ao longo da evolução e que são recriadas em laboratório pelos cientistas.

ENZIMAS

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

As Enzimas de Restrição são das ferramentas mais importantes usadas em Engenharia Genética.

Reconhecem determinadas sequências nucleótidas do DNA e fragmentam a molécula sempre que encontrem a tal sequência, produzindo extremidades coesivas.

Caso DNA de diferentes origens seja submetido à ação de uma mesma enzima de restrição, as extremidades coesivas serão complementares, sendo asssim possível uni-las criando moléculas com DNA de origens diversas.

DNA LIGASE

As DNA ligase são outra categoria de enzimas de grande importância em Engenharia Genética. Promovem as ligações entre nucleótidos de duas moléculas de DNA .

Quando duas extremidades coesivas de dois fragmentos de DNA, obtidos sob ação das enzimas de restrição, são postas em contacto, elas tendem a emparelhar, devido à complementariedade de bases, cabendo a ligação final dos fragmentos à DNA ligase.

Desta forma, obtém-se uma molécula única de DNA, com origem múltipla.

TRANSCRITASE REVERSA

A Transcritase Reversa é um outro tipo de enzima essencial em Engenharia Genética. Estas enzimas aparecem na constituição de alguns retrovírus - vírus cujo material genético é o DNA - que facilmente causam tumores.

A presença destas enzimas permite a estes vírus produzirem a partir do seu RNA moléculas de DNA que adicionam ao genoma do hospedeiro, após injeção do seu material genético nas células hospedeiras.

Uma vez isolada, a Transcritase Reversa pode ser utilizada para fabricar DNA, usando como moldes moléculas de RNA (uma transcrição em sentido contrário ao que se pensava ser único).

VETORES

Um dos objetivos da Engenharia Genética é a transferência de genes entre seres vivos.

Tratando-se de estruturas de dimensões bastante reduzidas, os genes, têm de ser associados a estruturas maiores, que assegurem a sua propagação e transferência de um ser vivo para outro.

Estas estruturas são chamadas de vetores de clonagem.

Porém, inserir DNA estranho numa célula exige que sejam ultrapassados vários obstáculos:

Conseguir que o DNA entre na célula;
Garantir que o mesmo se consiga replicar, sempre que a célula entre em divisão.

Para ultrapassar estes obstáculos é necessário:

Selecionar vetores com alguma habilidade natural para penetrarem dentro das células;
Introduzir o gene de interesse numa porção de DNA que contenha uma unidade de replicação, isto é, que seja reconhecida por uma DNA polimerase, iniciando assim o processo de replicação.

Tudo isto é possível quando se seleciona um bom vetor, ou seja, que tenha as seguintes características:

Ser de pequena dimensão quando comparado com os cromossomas da célula hospedeira;
Ter a capacidade de se replicar de forma independente relativamente à célula hospedeira;
Possuir zonas de restrição específicas, de forma a possibilitar a atuação de enzimas de restrição que possam posteriormente combiná-lo com o novo DNA;
Possuir um gene identificador ou gene repórter- gene que determina a produção de algo que permita detetar a presença do vetor.

Atualmente, em Engenharia Gemnética, são usados vários vetores, sendo a dimensão do DNA a transportar o principal elemento seletivo do vetor a usar. Geralmente, são usados plasmídeos, vírus ou cromossomas artificiais (sintetizados a partir de um plasmídeo), por ordem crescente da grandeza do DNA (1 Kb = 1000 pares de DNA).

Os plasmídeos podem estar presentes nas bactérias e são pequenos cromossomas circulares, com cerca de uma dúzia de genes, e com a sua própria unidade de replicação.

Os plasmídeos são considerados ótimos vetores, pois apresentam as seguintes características: são pequenos, geralmente possuem locais de restrição, muitos contém genes de resistência a antibióticos, têm uma origem de replicação e replicam-se sem dependerem do cromossoma da célula hospedeira.

Para além disso, os plasmídeos podem mover-se livremente entre bactérias, durante a conjugação das mesmas, adicionando novos genes às bactérias. Possuem também genes não essenciais para o metabolismo bacteriano, que podem ser responsáveis por metabolismos especiais ou por resistência a antibióticos.

A única desvantagem da sua utilizaçãoé o facto destes só permitirem a inserção de porções de DNA de dimensões bastante reduzidas - no máximo com 10 Kb.

Os vírus infetam normalmente as células hospedeiras, procarióticas ou eucarióticas, o que é uma característica que facilita e promove a sua utilização como vetores. Os mais utilizados são os bacteriófagos ou fagos, os vírus que infetam as bactérias.

Quando se pretende usar um fago como vetor, começa por se eliminar os genes virais que provocam a lise e a morte das células hospedeiras, substituindo-os por genes de interesse.

Uma vantagem da utilização destes vetores é o facto de permitirem a inserção de fragmentos de DNA de maiores dimensões (no máximo 25 Kb) e de serem mais rentáveis na produção de bibliotecas ou bancos de genes.

Quando o DNA a clonar é de dimensões muito grandes (superior a 50 Kb), tem de se usar outro tipo de vetores, os cromossomas artificiais (normalmente de leveduras). Estes vetores são sintetizados a partir de plasmídeos que contenham uma origem de replicação, locais de restrição e genes marcadores - segmentos de DNA localizados numa posição conhecida num determinado cromossoma.

De seguida o plasmídeo é cortado e são adicionados alguns fragmentos de DNA, mais especificamente centrómeros e telómeros de cromossomas de levedura.

Desta forma, este cromossoma, uma vez colocado numa célula hospedeira (de levedura) irá comportar-se como um cromossoma normal, podendo sofrer meiose e mitose naturalmente.

TÉCNICAS

TÉCNICA DO DNA RECOMBINANTE

Na técnica do DNA recombinante são várias as etapas:

Seleção do gene com interesse, sujeitando-o à ação de uma determinada enzima de restrição;
Seleção de um vetor, sujeitando-o ao mesmo tipo de enzima de restrição;
Junção de ambos os fragmentos de DNA (dado que têm extremidades coesivas complementares que resultaram da ação da mesma enzima de restrição).
Adição de DNA ligase, a qual irá estabelecer a ligação fosfo-diéster entre os fragmentos de DNA de origens diferentes, obtendo-se um DNA de origem híbrida - DNA recombinante.

TÉCNICA DO DNA COMPLEMENTAR

Esta técnica é utilizada para sintetizar DNA, usando como molde uma molécula de mRNA.

Para isso é necessário seguir diversas etapas:

Isolamento de uma molécula de mRNA de interesse;
Adição de desoxirribonucleótidos e da enzima transcritase reversa;
Transcrição de uma cadeia de DNA, por complementariedade, a partir do molde de mRNA;
Adição de enzimas que degradam a cadeia de mRNA (RNases), sobrando, assim, apenas a cadeia sintetizada de DNA;
Adição da enzima DNA polimerase e desoxirribonucleótidos, de forma a construir, por complementariedade de nucleótidos, a nova cadeia de DNA, obtendo-se por fim uma molécula de DNA de dupla cadeia - DNA complementar (cDNA).

TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

(PCR - polymerase chain reaction)

O PCR é uma técnica que ocorre in vitro, e que permite obter varias cópias de uma molécula de DNA (Fig. 106). Desta forma, sem necessidade de recorrer a células vivas para produzir DNA, é possivel amplificar pequenas amostras iniciais.

O PCR ocorre por ciclos, duplicando-se em cada um deles o número de moléculas de DNA.

Cada ciclo tem três fases:

1.ª FASE - A molécula original de DNA é desnaturada: para tal, sujeita-se a mesma a temperaturas muito elevadas, na ordem dos 95 °C, que quebram as ligações por pontes de hidrogénio entre as bases complementares.

2.ª FASE - Procede-se ao emparelhamento dos primers (pequenos fragmentos de DNA em cadeia simples que marcam, por complementaridade, em cada cadeia, os limites da porção a replicar). Este processo ocorre a uma temperatura adequada ao emparelhamento específico dos primers com as cadeias molde (por exemplo, 55 °C) e tem como objetivo amplificar apenas a porção de DNA compreendida entre dois primers (inclusive). Estes oligonucleótidos iniciadores são indispensă- veis porque as DNA polimerase não conseguem começar a polimerizar a partir de uma cadeia simples de DNA.

3.ª FASE - Ocorre a síntese de DNA, etapa que se processa a 72 °C e que requer a presença de desoxirribonucleótidos e de DNA polime rase, enzima que polimeriza nucleótidos.

Atualmente é utilizada para esta técnica a Taq polimerase, enzima isolada de bactérias termofilas, resistentes a altas temperaturas. Estas enzimas não desnaturam quando sujeitas às várias temperaturas a que ocorrem os ciclos de PCR, pelo que permitem a automatização deste processo.

Esta técnica apresenta, muitas aplicações, nomeadamente na clonagem de DNA, em estudos forenses, no diagnóstico de doenças hereditárias e infeciosas, em estudos moleculares de evolução e no mapeamento de genes.

NOTA:
SÓ AO FIM DO TERCEIRO CICLO PCR É QUE SE OBTÊM MOLÉCULAS DE DNA EM CADEIA DUPLA COM O TAMANHO EXATO COMPREENDIDO ENTRE OS DOIS PRIMERS.

APLICAÇÕES

A Engenharia Genética utiliza as suas técnicas para:

Obtenção de organismos geneticamente modificados (OGM) - Ex: Plantas resistentes a herbicidas e plantas reistentes ao frio; Animais para consumo humano com maior desenvolvimento;
Tratamento de doenças genéticas pela inserção de cópias (alelos) de um gene em células de pacientes que transportam os alelos mutados;
Produção de plásticos biodegradáveis em plantas;
Produção de bactérias que degradam poluentes;
Vacinas de DNA - imunização genética com a administração de material genético (DNA) que conduz à expressão in vivo de proteínas que induezm resposta do sistema imunitário.

VÍDEOS SOBRE APLICAÇÕES DA ENGENHARIA GENÉTICA